下呼吸道病原菌检测迎来“时间革命”

　　一次小小的肺炎，差点要了吴华(化名)的命。从社区诊所到区中心医院，最后因重症肺炎病危，不得已转入北京大学人民医院。

　　“转到医院的时候，我们先用抗体检测，结果显示，嗜肺军团菌阴性，后来选用一种新的检测却提示嗜肺军团菌阳性，结合临床其他表现，完全可以诊断为军团杆菌肺炎，遂采用感染病原导向性治疗，选择红霉素类抗菌药治疗，效果非常好，患者很快就康复出院。”北京大学人民医院呼吸与危重症医学科专家说。

　　专家所说的新的检测，是一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术，不抽血，只需要一口痰，仅仅两个小时，便可一次性检测出肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等多种临床常见的下呼吸道病原菌。

　　而之前的传统病原菌检测，如痰涂片、培养、血清学检测等方法，则至少需要2~3天的时间，并且还容易有敏感性不足等问题。

　　“这直接关乎临床决策，影响患者的治疗效果。”专家认为，这项新的技术，可以为下呼吸道感染病原菌检测迎来一场“时间革命”。“它不仅可以大大缩短诊断周期，及早明确感染病原菌，还可以大大减少患者的痛苦，节省社会资源，同时避免病原菌由于使用抗菌药物压力多大而产生耐药。”

　　而传统诊疗中，往往患者先抽血化验，医生通过常规检测等经验推断到底是病毒感染，还是细菌感染，还是混合感染。这对于患者来说，不仅耗费时间长，疾病诊断不准确，还可能造成抗菌药物过度使用或滥用。

　　下呼吸道感染形势严峻

　　所谓的呼吸道感染是指病原体从人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸道感染侵入而引起的有感染性疾病。据世界卫生组织2013年发布的最新统计结果显示，世界十大死亡病因中下呼吸道感染(5.9%)位居第三位，仅次于冠心病与中风;而位居第四位的慢性阻塞性肺病也多与感染有关。肺炎作为全球感染性疾病最主要的致死病因之一，更是导致儿童死亡的罪魁祸首。

　　“以急诊科为例，各种感染或合并感染占急诊就诊量的第一位，而其中急性呼吸道感染又排名第一。老年患者中因呼吸道感染引发的呼吸衰竭和心力衰竭导致的死亡占老年人死亡病因的第一位。因此，对呼吸道感染的及时诊断和正确处理是提高疗效、减少死亡率的关键”。解放军306医院急诊科主任夏鹄表示。

　　但在实际临床工作中，包括急诊科在内的临床医生又不得不面临的一个问题：无法在第一时间获得病原学诊断结果。

　　“这就只能依靠医生进行经验性用药。”专家说，由于病原学检查的滞后性，细菌耐药问题越来越严重，可选的治疗方法也变得越来越局限。

　　为此，2014年11月出版的国际著名《柳叶刀感染性疾病》(Lancet Infect Dis)杂志还专门刊发了“新出现的呼吸道感染”系列文章，呼吁全社会应该警惕新的、难治性的呼吸道细菌、病毒和真菌病原体的广泛传播。

　　检验新方法使病原学检测不必久等

　　那么，理想状态下，临床医生遇到呼吸道感染患者应该如何治疗呢?面对记者的提问，专家表示，首先应该对患者进行病原学检测，以确定感染病原菌的类型，再进行有针对性的治疗。“这就好比射击比赛一样，你只有知道了靶心的位置，再选择合适的子弹，才能提高中靶率。”

　　“病原学检测这样不仅可以降低不恰当治疗引起治疗失败和死亡的风险，还能减少不必要的抗菌药物使用，从而降低药物毒性，药物相互作用、耐药风险以及治疗费用，还可以为流行病学提供资料，为经验性治疗提供依据。”专家说。

　　据统计，我国抗菌药物销售额占前100位药品销售总额的47%，而欧美仅为约10%。仅超前使用第三代头孢菌素类药物，全国一年就多花掉7亿多元。

　　“这就更加凸显出病原学检测的必要性。”北京协和医院检验科肖盟说，对于病原学检测，不论是临床医生，还是患者，都希望得到的结果是：结果回报快速、准确、阳性率高，没有假阳性，能够区分定值与感染。而传统的病原学检测都有各自不足之处，比如报告周期长、操作复杂、敏感性有限等等。

　　“环介导等温扩增技术进行病原学检测，具有高灵敏、高特异、高速度、易推广等优势。”专家解释环介导等温扩增技术的原理，是针对病原6个靶基因设计4种引物，引入环引物，使反应加速，再应用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在等温条件下催化合成，最终产物由一系列反向重复靶序列构成的茎环DNA结构片段。

　　一项发表在《柳叶刀感染性疾病》杂志上的研究成果显示，LAMP法检测呼吸道及血液样本中脑膜炎双球菌的敏感性为89%，特异性达到100%，阳性预测值100%，阴性预测值98%。

　　可喜的是，利用该技术原理，北京博奥晶典生物技术公司已经研发生产出了下呼吸道感染病原菌核酸检测试剂盒，并于4月获得了中国食品药品监督管理局(CFDA)颁发的医疗器械产品注册证。

　　新方法是传统方法有效补充

　　既然LAMP技术如此“强大”，能否取代传统病原学检测方法呢?面对记者的提问，肖盟给出的答案是：不能取代，新方法与老方法是相互补充的关系。“新的诊断技术和方法必将在病原微生物的诊断分析方面起到越来越重要的作用，但多种检测技术优势互补、有效联合才是病原学发展的方向。”

　　当谈到这一项新技术能否惠及到基层医疗机构时，博奥晶典董事长、总裁许俊泉表示：“由于该项检测试剂盒和配套仪器都是自动化的检测系统，便携、操作简单，且价格合理，将会更受到基层医疗机构的欢迎。”

　　此外，对于实验室条件与操作人员资格方面，新技术也并不“苛刻”。“整个便携仪器体积小，重量不超过5千克，即便是电池供电，仍可持续工作8小时。”许俊泉说。

　　“如果产品能够在原有技术的基础上，提高样本的通量，同时与腹泻病原检测、呼吸道病毒检测、耐药基因检测进行联合检测，这将会有很大的发展空间。”肖盟对产品的未来发展有如是期望。

　　作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞(主要是CD4+ T细胞)时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入到宿主基因组中以便进行复制和合成新的病毒颗粒。

　　在一项新的研究中，来自美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1 DNA中的一段序列。这一突破是开发一种潜在地抵抗HIV感染的治疗策略的关键一步。相关研究结果发表在2016年5月19日那期Gene Therapy期刊上，论文标题为“Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study”。

　　论文通信作者、天普大学刘易斯-卡茨医学院神经病毒学中心主任Kamel Khalili博士解释道，“在这项概念验证的研究中，我们证实我们的基因编辑技术能够高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。”

　　当前的治疗HIV感染的方法集中于抗逆转录病毒药物的组合使用。尽管抗逆转录病毒药物疗法能够有效地抑制HIV复制，但是这不能够将HIV-1从被HIV感染的细胞中清除。再者，当抗逆转录病毒疗法停止时，HIV复制卷土重来，从而使得病人面临着患上获得性免疫综合征(AIDS，一种由HIV感染导致的疾病)的风险。这种潜伏性感染之所以产生是因为HIV DNA能够持续存在于CD4+记忆T细胞的基因组中和可能其他的细胞储存库中，在那里，HIV病毒保持潜伏状态，不受当前疗法的影响。

　　在早前的研究(Scientific Reports, doi:10.1038/srep22555)中，Khalili博士和同事们能够证实他们基于CRISPR/Cas9技术的新基因编辑系统在体外能够很好地从被感染的细胞中清除HIV-1，而且对宿主细胞没有任何副作用。在针对临床样品---包括来自HIV感染者的T细胞在实验室培养时增殖---的体外实验中，他们证实在经这种基因编辑系统治疗后，病毒复制显著降低(详细新闻报道参见：Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1)。

　　这项最新研究的设计目的是专门测试这种基因编辑技术是否也能够清除转基因大鼠和小鼠体内的HIV-1，其中HIV DNA已被整合进这两种实验性转基因动物的每个器官每个细胞的基因组中。为了让这种基因编辑技术应用于活动物体内的细胞中，Khalili博士和同事们使用重组腺相关病毒(rAAV)载体运送系统。他们也对这种基因编辑系统进行基因改造以便能够切割整合到宿主细胞基因组中的HIV-1 DNA，从而导致病毒DNA片段从宿主基因组中切除。

　　在利用rAAV载体运送系统将 CRISPR/Cas-9分子运送到这两种转基因动物的血液中两周后，研究人员分析了从这些动物体内收集的组织中的HIV-1 DNA。分析结果证实在包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺部和脾脏在内的每个组织中以及血细胞中，HIV-1 的特定DNA片段都被从病毒基因组中切除。在分析模式大鼠体内的病毒RNA时，研究人员证实这一策略显著地降低循环淋巴细胞和淋巴结中的HIV-1 RNA水平，这就表明病毒基因组片段切除显著地影响携带整合性病毒DNA的细胞中的HIV-1基因表达。

　　Khalili博士说，“这种rAAV运送系统进入含有HIV-1基因组的很多器官中并对病毒DNA进行基因编辑的能力是这种策略也能够克服潜在性HIV感染的细胞中的病毒再激活的重要指标。它充当着一种潜在地治疗HIV感染者的方法。”用于这项研究中的这种切除策略导致HIV-1 DNA的较大片段被切除，也就消除了在进行治疗时任何可复制性HIV病毒逃避事件出现的可能性。

　　这项新研究的临床影响是深远的。这种基因编辑平台本身可能能够根除病人体内的HIV-1 DNA，但是它也是高度灵活的，可能能够潜在地与现存的抗逆转录病毒药物组合使用从而进一步抑制病毒RNA复制。它可能也能够经改造后靶向作用于发生突变的HIV-1毒株。

　　Khalili博士注意到在未来几年，基于这种方法的临床试验可能会开展。与此同时，下一步就是在更大的动物群体中开展追踪研究，在这项追踪研究中，研究人员计划监控这种治疗方法的疗效、安全性和其他的重要指标。