首次利用CRISPR/Cas9在体内切除HIV DNA片段

　　作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞(主要是CD4+ T细胞)时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入到宿主基因组中以便进行复制和合成新的病毒颗粒。

　　在一项新的研究中，来自美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1 DNA中的一段序列。这一突破是开发一种潜在地抵抗HIV感染的治疗策略的关键一步。相关研究结果发表在2016年5月19日那期Gene Therapy期刊上，论文标题为“Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study”。

　　论文通信作者、天普大学刘易斯-卡茨医学院神经病毒学中心主任Kamel Khalili博士解释道，“在这项概念验证的研究中，我们证实我们的基因编辑技术能够高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。”

　　当前的治疗HIV感染的方法集中于抗逆转录病毒药物的组合使用。尽管抗逆转录病毒药物疗法能够有效地抑制HIV复制，但是这不能够将HIV-1从被HIV感染的细胞中清除。再者，当抗逆转录病毒疗法停止时，HIV复制卷土重来，从而使得病人面临着患上获得性免疫综合征(AIDS，一种由HIV感染导致的疾病)的风险。这种潜伏性感染之所以产生是因为HIV DNA能够持续存在于CD4+记忆T细胞的基因组中和可能其他的细胞储存库中，在那里，HIV病毒保持潜伏状态，不受当前疗法的影响。

　　在早前的研究(Scientific Reports, doi:10.1038/srep22555)中，Khalili博士和同事们能够证实他们基于CRISPR/Cas9技术的新基因编辑系统在体外能够很好地从被感染的细胞中清除HIV-1，而且对宿主细胞没有任何副作用。在针对临床样品---包括来自HIV感染者的T细胞在实验室培养时增殖---的体外实验中，他们证实在经这种基因编辑系统治疗后，病毒复制显著降低(详细新闻报道参见：Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1)。

　　这项最新研究的设计目的是专门测试这种基因编辑技术是否也能够清除转基因大鼠和小鼠体内的HIV-1，其中HIV DNA已被整合进这两种实验性转基因动物的每个器官每个细胞的基因组中。为了让这种基因编辑技术应用于活动物体内的细胞中，Khalili博士和同事们使用重组腺相关病毒(rAAV)载体运送系统。他们也对这种基因编辑系统进行基因改造以便能够切割整合到宿主细胞基因组中的HIV-1 DNA，从而导致病毒DNA片段从宿主基因组中切除。

　　在利用rAAV载体运送系统将 CRISPR/Cas-9分子运送到这两种转基因动物的血液中两周后，研究人员分析了从这些动物体内收集的组织中的HIV-1 DNA。分析结果证实在包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺部和脾脏在内的每个组织中以及血细胞中，HIV-1 的特定DNA片段都被从病毒基因组中切除。在分析模式大鼠体内的病毒RNA时，研究人员证实这一策略显著地降低循环淋巴细胞和淋巴结中的HIV-1 RNA水平，这就表明病毒基因组片段切除显著地影响携带整合性病毒DNA的细胞中的HIV-1基因表达。

　　Khalili博士说，“这种rAAV运送系统进入含有HIV-1基因组的很多器官中并对病毒DNA进行基因编辑的能力是这种策略也能够克服潜在性HIV感染的细胞中的病毒再激活的重要指标。它充当着一种潜在地治疗HIV感染者的方法。”用于这项研究中的这种切除策略导致HIV-1 DNA的较大片段被切除，也就消除了在进行治疗时任何可复制性HIV病毒逃避事件出现的可能性。

　　这项新研究的临床影响是深远的。这种基因编辑平台本身可能能够根除病人体内的HIV-1 DNA，但是它也是高度灵活的，可能能够潜在地与现存的抗逆转录病毒药物组合使用从而进一步抑制病毒RNA复制。它可能也能够经改造后靶向作用于发生突变的HIV-1毒株。

　　Khalili博士注意到在未来几年，基于这种方法的临床试验可能会开展。与此同时，下一步就是在更大的动物群体中开展追踪研究，在这项追踪研究中，研究人员计划监控这种治疗方法的疗效、安全性和其他的重要指标。

　　在一项新的研究中，来自美国加州大学旧金山分校和纪念斯隆-凯特琳癌症中心等机构的研究人员开发出一种潜在的抗癌药物，该药物利用一种独特的策略阻断mTOR，其中mTOR是一种有助促进多种癌症生长的分子。在动物实验中，这种药物降低对较早一代mTOR抑制剂产生耐药性的肿瘤大小。相关研究结果于2016年5月18日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Overcoming mTOR resistance mutations with a new-generation mTOR inhibitor”。论文通信作者为来自加州大学旧金山分校的Kevan Shokat和来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Neal Rosen。

　　几种抗癌药物试图通过阻断mTOR来阻止肿瘤生长，其中mTOR是细胞生长调节网络中的一个关键组分，但在癌细胞中，这个调节网络经常受到破坏。最早的这些药物，包括雷帕霉素和相关的被称作雷帕霉素类似物(rapalog)的分子，在治疗包括肾癌和乳腺癌在内的一些癌症中取得一些成功。设计出的第二代mTOR抑制剂要比rapalog更强效地阻断mTOR信号，当前正在临床试验中接受评估。

　　不幸的是，肿瘤在有效治疗几个月或几年后能够对rapalog产生耐药性，而且很可能也会对第二代mTOR抑制剂产生耐药性。Shokat说，这是分子靶向癌症治疗药物的一个常见问题。但是如果科学家们能够理解让癌细胞对药物产生耐药性的突变，那么他们能够努力开发下一代抗癌药物。

　　Shokat和他的同事们想要解决这个问题，为此开始考虑开发第三代mTOR抑制剂而不用等待病人对最新的治疗药物产生耐药性。为了了解耐药性如何可能产生，Rosen团队让他们在实验室培养的乳腺癌细胞接触雷帕霉素或一种被称作ADZ8055的第二代mTOR抑制剂三个月。大多数乳腺癌细胞死亡，但是正如期待中的那样，一些癌细胞找到存活下来和增殖的方法。

　　研究人员研究了这些耐药性的乳腺癌细胞以便鉴定出允许它们茁壮成长的特异性突变，并且作出推理：同样的突变可能也出现于接受这些药物治疗的病人体内。随后，Rosen团队在对来自癌症病人的肿瘤进行分门别类的基因数据库中寻找突变。

　　令他们吃惊的是，让他们在实验室培养的乳腺癌细胞对ADZ8055产生耐药性的突变也存在一些病人的乳腺癌中，甚至是在他们接受治疗之前。Shokat说，“这真地令人吃惊，这是因为它们通常是药物诱导的突变。”这些突变也存在于大约10%的肾细胞癌(最为常见的肾癌)中，提高mTOR活性，这意味着它们在ADZ8055存不存在时都能促进肿瘤生长。

　　Shokat说，携带这些突变的病人从不会对这种第二代mTOR抑制剂产生反应。“这项研究立即从‘病人将产生这些突变，因此我们将需要一种药物[进行治疗]’改变为‘哇，病人已经产生这些突变，他们对我们在诊所中使用的药物再次产生耐药性’。”

　　研究人员知道他们需要与之前的mTOR抑制剂作用机制不同的新一代抑制剂。为此，Shokat从免疫系统中获得灵感。多亏抗体的Y性结构具有两个抗原结合端，它们善于结合到快速发生变化的靶标上。Shokat说，这两个结合位点让抗体对它们的靶标具有较强的亲和力，因此，他想模拟这一策略：设计一种结合到mTOR两个位置上的抑制剂。

　　他是通过将一种第一代mTOR抑制剂---结合到mTOR分子的一部分---与一种第二代mTOR抑制剂---靶向结合于mTOR分子一个不同的口袋---连接在一起来做到这一点的。这种新的被称作Rapalink 的mTOR抑制剂结合到mTOR的两个位点上，因而比早期的mTOR抑制剂更牢固地结合到mTOR上。

　　更重要的是，这种双功能抑制剂能够抓牢mTOR，即便是它含有阻止较为简单的抑制剂结合的突变。这是因为mTOR上的两个结合位点并不需要与这种抑制剂完全匹配。Shokat解释道，一旦这个抑制剂的一端结合到它的靶标上，它的另一端也离它自己的结合口袋靠得很近，因此也可能结合上去。

　　研究人员证实Rapalink能够进入癌细胞内部，关闭mTOR信号，即便是这些癌细胞对早期的抑制剂产生耐药性。他们也在动物实验中测试了Rapalink抑制肿瘤生长的能力，结果发现它降低对第一代或第二代mTOR抑制剂产生耐药性的肿瘤大小。

　　研究人员已将Rapalink许可给生物医药公司Kura Oncology。该公司将继续评估它作为癌症治疗药物的潜力。Shokat和Rosen是该公司的科学顾问。