痰液中找到结核菌是诊断肺结核的最可靠依据。检查方法很多，有直接涂片、集菌法和培养法等。涂片法比较简单，集菌法阳性率较高，培养法较精确可靠。培养法检查阳性时应该做药物敏感性试验（简称药敏），这对选择有效的抗结核药物治疗很有帮助。在空洞型病人的痰液中，直接涂片一般就可以找到结核菌。如多次涂片找不到结核菌可采用集菌法检查，必要时可将痰液或其分泌物作动物接种。
1、直接涂片作抗酸染色，在显微镜油镜下检查，可在蓝色背景中见到红色细长的结核菌。
2、集菌法有漂浮法和沉淀法两种。漂浮法不需离心设备，操作简便，但需要注意水中可能有非致病的抗酸杆菌，造成假阳性。
3、作结核菌的培养与药敏时，将集菌法的沉淀物直接接种到固体培养基以及含有不同药物浓度的固体培养基斜面上，定期观察菌落的出现、其色泽形态与耐药程度，一般需要4-6周方有结果。