摘要 病原微生物感染诱导宿主细胞凋亡是一种普遍的现象。细胞凋亡抑制为病原体的生长、增殖和在体内的扩散创造了便利的条件。本文着重从热休克蛋白、核因子-κB、半胱天冬酶类等方面综述了弓形虫感染与宿主细胞凋亡抑制的研究进展。
关键词 弓形虫 细胞凋亡 热休克蛋白 核因子-κB 半胱天冬酶类
某些病毒和细菌感染细胞后，可抑制宿主细胞凋亡（apoptosis）[1-3]。人们对此有趣的现象进行了大量的研究，现已将其机制基本阐明。最近有人发现，一些专性细胞内寄生原虫感染宿主细胞后，也可抑制其发生细胞凋亡[4-9]。现将隶属该类原虫的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. g.）的相应研究进展综述如下。
1 弓形虫的病原生物学和生物化学
弓形虫属于真球虫目、弓形虫科。发育过程需要两个宿主，经历无性生殖和有性生殖两个世代的交替。多种鸟类、各种哺乳动物和人等是中间宿主，猫科动物是终末宿主兼中间宿主。弓形虫在中间宿主体内只能进行无性生殖，在终末宿主体内可进行无性生殖和有性生殖。弓形虫可寄生在除红细胞外的几乎所有有核细胞中，引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫整个生活史过程有5种主要形态：滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，其中对人体致病及与传播有关的发育期为滋养体、假包囊与包囊和卵囊。滋养体侵入宿主细胞后，在免疫功能正常时，形成包囊结构。当机体免疫功能低下时，包囊破裂，大量速殖子进入新的组织细胞，引发机体明显的病理变化甚至死亡。
弓形虫是单细胞真核生物。单倍体核至少含8条染色体，线粒体DNA呈环状。弓形虫基因组相对较小，约为9×107bp。据推测速殖子至少含1000多种蛋白质，但虫体表面主要蛋白只有5-7种。目前发现的速殖子特异蛋白有P21[10]、P22[11]、 P30[12]和P28[13]等，缓殖子特异蛋白有SAG4[14]、MAG1[15]、BAG5[16]、LDH[17]和BAG1[15, 18]等。弓形虫的特异蛋白直接关系到弓形虫的免疫学、致病性、毒力及对被感染宿主细胞信号转导的干扰作用。
2 弓形虫感染对宿主细胞凋亡的抑制
研究发现，弓形虫感染多种细胞后，能够抑制不同因素诱导的细胞凋亡。Nash等[4]报道感染弓形虫的巨噬细胞抑制放线菌素D或环己酰亚胺诱导的凋亡；感染弓形虫的A20细胞抑制细胞毒性T淋巴细胞和钙离子载体beauvericin诱导的凋亡；感染弓形虫的WEHI231细胞抑制γ-射线辐射诱导的凋亡；感染弓形虫的P185肥大细胞瘤细胞抑制紫外线辐射诱导的凋亡；感染弓形虫的CTLL-2细胞抑制IL-2缺失诱导的凋亡。Goebel等[19-21]也报道感染弓形虫的人HL-60细胞和U937细胞抑制放线菌素D/环己酰亚胺或TNF-α/环己酰亚胺联合处理诱导的凋亡。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。凋亡的调控具有双向性，诱导因素大于抑制因素时，细胞出现凋亡；诱导因素小于抑制因素时，凋亡被抑制，细胞维持自身的完整性。弓形虫感染抑制宿主细胞凋亡，可能是由于虫体入侵激活或加强了凋亡抑制信号的转导。进一步研究发现，参与此凋亡抑制调控的因子主要包括热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、半胱天冬酶类 (caspases) 和其它因子。
2.1 HSPs
HSPs又称应激蛋白（stress proteins，SPs），是1962年Ritassa在对果蝇唾液腺的研究中发现的。HSPs是一组在进化上高度保守的蛋白质，是细胞在各种不利于自身的因素（包括物理的、化学的和微生物感染等）刺激下所表现的一种以基因表达和调控方面发生改变的反应。通过此种方式，诱导HSPs产生而启动内源性保护机制。HSPs在原核和真核细胞中广泛存在。根据分子量、等电点不同，HSPs被分成5大类（或家族）：低分子量HSP家族、中等分子量HSP家族（如HSP65）、HSP70家族、HSP90家族和HSP110家族，每个家族又有多个成员组成。
Hisaeda等[22]报道，Beverly弱毒株弓形虫感染巨噬细胞后，抑制其发生凋亡，而RH强毒株感染的巨噬细胞则出现凋亡。Hisaeda等[22]认为，HSP65在宿主细胞内有无表达是造成上述现象的原因。在体内，Beverly弱毒株可以刺激依赖γδ-T细胞的HSP65表达，而RH强毒株则不能。体外试验采用HSP65反义寡核苷酸特异阻断HSP65基因的表达，或用单克隆抗体使HSP65基因表达所依赖的γδ-T细胞缺失，结果感染Beverly弱毒株的巨噬细胞也发生凋亡。值得注意的是，HSP65表达的时间直接关系到其对凋亡的影响结果。HSP65诱导表达必须先于细胞感染，才能发挥抑制凋亡作用。当表达时间滞后时，HSP65甚至诱导凋亡。DeMeester等[23]将此有趣的现象形象地描述为“heat shock paradox”。除弓形虫外，HSP65的抗凋亡作用也存在于plasmodium yoelii[24]、硕大利什曼原虫（Leismania major）[25]和克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）[26]。
目前，仍不清楚HSP65如何抑制凋亡的信号转导。Saleh等[27]和Pandey等[28]的试验提示HSP65的作用靶位可能是凋亡小体（apoptotic body）。Hisaeda等[22]推测HSP65可能结合并中和弓形虫产生的有害分子，或者促使内源性抗凋亡蛋白成熟和移位到作用靶位，发挥直接或间接的抗凋亡作用。
除HSP65外，HSP70可能也参与弓形虫感染抑制宿主细胞凋亡的过程。用槲皮素（Quercetin）或HSP70反义脱氧寡核苷酸阻断HSP70基因的表达后，肿瘤细胞增生被抑制并出现凋亡[30]。有报道称，HSP70通过影响线粒体细胞色素C（mitochondrial cytochrome C，Cty C）释放和caspases激活[31-32]，或直接与凋亡细胞蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，APAF-1）（ced类似物）作用发挥抗凋亡作用[27, 28, 32]。HSP70还能与p53蛋白结合，抑制p53的转录活性，阻断生长抑制基因的转录和表达，使细胞进入增殖状态。
需要强调的是，宿主细胞和病原体都可表达HSPs。宿主细胞的胞浆内和细胞膜表面均有HSPs表达。胞浆HSPs保护感染细胞免遭有害物质的刺激。细胞表面HSPs以非免疫性质的自我/非自我识别方式，或充当细胞毒性作用和γδ-T细胞作用的靶位构成宿主的特异性防御系统[22]。
巨噬细胞是抗弓形虫感染的最重要效应器细胞，主要通过产生NO 和炎性前细胞因子（pro-inflammatory cytokines）发挥作用[29]。弓形虫强毒株诱导巨噬细胞凋亡而弱毒株抑制凋亡，提示细胞凋亡也参与了弓形虫的致病作用（pathogenicity）[22]。抑制HSPs表达诱导巨噬细胞凋亡的强毒株由于逃避了宿主的防御反应，从而引起严重的临床病变。
2.2 NF-κB
1986年，Sen和Baltimore从B淋巴细胞的核抽提物中检测到一种核蛋白因子，发现该物质能与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列特异结合，并促进κ链基因表达，他们将其称为NF-κB。NF-κB几乎存在于所有细胞中。未受刺激时，胞质中NF-κB 的P65亚基与IκB蛋白结合，覆盖NF-κB P50亚基的核定位信号，使NF-κB与IκB形成三聚体复合物，处于未活化状态，不具备调节基因转录的能力。当细胞受到刺激时，蛋白激酶被激活，使得IκB磷酸化并发生裂解，解离出的NF-κB随即迅速由胞质位移进入细胞核。入核的NF-κB二聚体与基因上的κB位点特异结合，直接上调细胞凋亡蛋白抑制剂（c-IAP1、c-IAP2和X-IAP1）[32-34]、TNF受体相关因子（TRAF1和TRAF2）[32, 35, 36]、Bcl-2同系物A1/Bfl-1h和Bcl-XL[32, 37, 38]、锌指蛋白A20、超氧化物歧化酶等抗凋亡基因的表达，抑制细胞凋亡。
Gazzinelli等[39]通过体内试验证实，弓形虫感染能激活NF-κB。Caamano等[40]也报道，NF-κB2（p100/p52）参与调控感染ME株弓形虫的T细胞发生的凋亡。当敲除NF-κB2基因后，感染ME株的T细胞显现高水平凋亡。有关NF-κB与弓形虫感染抑制凋亡关系的资料非常有限。对弓形虫感染如何激活NF-κB，激活的NF-κB如何将来自上游的信号向下游传递，以及此途径能否最终诱导细胞凋亡，都有待进一步研究和证实。
2.3 caspases
caspases是细胞凋亡信号的关键组分，它是一种半胱天冬蛋白酶，能水解底物蛋白中的Asp-X的肽键。此家族被证实的成员已超过10个。它们都有相同的蛋白酶催化功能区和底物结合区结构，活性中心氨基酸序列为QACRG。caspases在正常细胞中以酶原形式存在，细胞接受死亡信号后，通过形成作为启动作用的caspases（如caspases 8）的寡聚体而自身催化或相互激活，然后再激活具备死亡效应器作用的caspases 3、6和7，由它们降解聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶（poly(ADP- ribose) polymerase，PARP）、DNA依赖激酶、核纤层蛋白（lamin）、胞衬蛋白(fodrin)和70kD U1小核糖核蛋白等，最终导致细胞结构破坏，DNA断裂，染色体浓缩，使细胞凋亡。caspases家族的信号转导位于整个凋亡信号转导的下游，很多来自上游的信号最终都要汇集于此或者经过caspases体现其凋亡调控作用[41]
粒酶B（granzme B, Gran B）是由细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤细胞表达的一种与细胞质颗粒相关的丝氨酸蛋白酶，通过Gran B的释放可快速降解DNA和诱导靶细胞凋亡。但是感染了弓形虫的细胞，则直接抑制Gran B介导的凋亡诱导作用[4]。Gran B的效应器已被确认为是caspase 3，示意弓形虫感染可能干扰正常的caspase 3激活。另外Goebel和他的同事[21]证实，感染了弓形虫的人HL-60细胞和U937细胞，经凋亡诱导因素处理后，caspase 3和caspase 9裂解成活性形式的反应受到显著的抑制。
caspases 的活性也受NF-κB的调控，两者呈被调控和调控的关系。弓形虫感染宿主细胞后，先激活NF-κB[39]，激活的NF-κB进而抑制caspases的裂解和活化，诱导凋亡抑制。
2.4 其它凋亡调控因子
Cty C是线粒体呼吸链的一个基本成分，正常时位于线粒体膜内并松散地附着于线粒体膜的内表面。Cty C一旦游离于细胞质中，其立即与细胞质中其它成分相互作用，激活caspases，诱导细胞凋亡的发生如染色质浓缩和核碎裂。这一过程可被Bcl-2过表达所抑制。Cty C从细胞线粒体转移到细胞质，被认为是多种细胞死亡模型如Fas、紫外线、叉孢素（stauroporin，SSP）、鬼臼乙叉甙等诱导的凋亡中的重要环节。
PARP是存在于多数真核细胞中的一个蛋白质翻译后修饰酶，它以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）为底物，催化其裂解为二磷酸腺苷核糖（ADP-ribose）和尼克酰胺两部分，并将ADP-ribose转移到受体蛋白Glu残基上，该酶连续作用便给蛋白质分子接上了一条二磷酸腺苷核苷基的聚合链。研究表明，组蛋白H1、拓扑异构酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、Ca2+和Mg2+依赖的DNase等多种核蛋白都是PARP的受体蛋白。PARP与DNA损伤的修复有关。在许多细胞系统包括胸腺细胞、HL-60细胞和乳腺细胞等都已证实PARP是caspases最富有特征性的蛋白裂解底物。因PARP裂解需要NAD+和ATP，所以caspases裂解PARP不仅直接破坏内环境的稳定，并抑制其对DNA损伤的修复作用，加速DNA降解和细胞凋亡的发生。
3 结语
参与凋亡抑制调控的因子有很多种类，不同的因子循着不同的信号转导途径对凋亡进行调控。某一信号途径的信号传递不是直线式的，信号转导的最重要特点是多途径的网络式作用。目前对弓形虫感染引发宿主细胞凋亡抑制的研究尚处于初级阶段，积累的资料极为有限，大量的探索性研究有待人们去尝试。
外源寄生物入侵宿主细胞后抑制细胞凋亡，是一种非常普遍的现象，在病毒和细菌都有大量报道。早期的研究主要集中在病毒和细菌。近来发现在专性细胞内寄生原虫也有此现象，除本文述及的弓形虫外，被报道的还有利氏曼原虫（Leishmania sp.）[5]、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）[6]、泰累尔梨浆虫（Theileia sp.）[7]、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）[8]、微孢子虫（microsporidian Nosema algerae）[9]等。
细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程。外源寄生物入侵宿主细胞后，一方面诱导凋亡破坏细胞，引发局部炎症。另一方面抑制凋亡维持细胞完整性，造成持续性感染，因此宿主细胞凋亡可以视为是一种自卫反应。弓形虫感染宿主细胞后，抑制凋亡使细胞维持自身的完整性，逃避了宿主防御系统的杀灭作用，存活时间得以延长，为自身在细胞内的生长、增殖和体内扩散创造了条件。对此现象进行深入的研究有着深刻的意义，既可以探究寄生物的致病机理，找寻防治相应疾病的新途径和方法，又可为细胞的信号转导积累资料。
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